In der Molekularbiologie kann eine gute Pufferauswahl und -vorbereitung für verschiedene DNA-Isolierungsschritte der Unterschied sein, ob man zur Proteinexpression übergeht oder ein anderes Maxi-Prep-Kit für den Neuanfang öffnet. Trotz ihrer entscheidenden Bedeutung sind Pufferrezepte oft genau das - Rezepturen, die für die verschiedenen Komponenten ohne Begründung oder Begründung geschrieben werden. Ein solcher Puffer ist Glucose-Tris-EDTA- oder GTE-Puffer.
$config[code] not foundWofür wird GTE verwendet?
GTE wird verwendet, um Bakterienzellpellets vor dem Lysieren (Aufbrechen) der Zellen und dem Ernten der darin enthaltenen Plasmid-DNA zu resuspendieren. Lysozym, das die Zellmembranen erweicht, wird häufig zusammen mit dem GTE-Puffer zugegeben. Das Erreichen einer homogenen Suspension ganzer Zellen während dieses Schritts, damit die anschließend zugesetzte Lyse-Lösung zu allen Zellen gelangen kann, ist der Schlüssel zu guten DNA-Ausbeuten. GTE dient dazu, dies zu tun und bietet gleichzeitig eine stabile Umgebung für die DNA.
Glukose für die Osmolarität
GTE-Puffer wird mit 50 mM (millimolarem) Glucosezucker versetzt, um die Osmolarität aufrechtzuerhalten, wenn die Konzentration der gelösten Stoffe außerhalb der Zellen nahe bei der Konzentration innerhalb der Zellen liegt. Dies verhindert eine vorzeitige Zelllyse, die aufgrund von Aggregation und Abbau zu geringeren DNA-Ausbeuten führen kann. Die anderen Komponenten des Puffers tragen ebenfalls zur Osmolarität der Lösung bei, aber Glucose ist kein Elektrolyt und daher eine gute Wahl, da sie die Puffereigenschaften der Lösung nicht beeinträchtigt.
Tris für pH-Stabilität
Tris ist der Kurzname für Tris (hydroxymethyl) aminomethan, ein sehr häufiger pH-Puffer. Im Fall von GTE-Puffer wird das Säuresalz (Tris-HCl) in einer Konzentration von 25 mM zum Puffer gegeben. Dies hält den pH-Wert der Lösung auf einem nahezu physiologischen Wert von 8,0, einem idealen pH-Wert zum Verhindern einer Säurehydrolyse (Abbau) der Plasmid-DNA und unerwünschter Nebenreaktionen der anderen Zellkomponenten.
EDTA verhindert DNA-Abbau
EDTA oder Ethylendiamintetraessigsäure fängt Metallionen aus der Lösung ein oder "chelatisiert" sie, sodass sie nicht an unerwünschten Nebenreaktionen teilnehmen. In GTE-Puffer wird EDTA bei 10 mM zugegeben. Sein Hauptzweck besteht im Puffer zum Aufrunden von freiem Zink, Magnesium und Kalzium, wodurch der Abbau der DNA auf bestimmten Wegen, die diese Metalle erfordern, verhindert wird.
Einige wichtige Tipps
Halten Sie Ihren GTE-Puffer kalt und stellen Sie ihn in kleinen Mengen her, um das Wachstum unerwünschter Bakterien zu verhindern. Zucker und der kontrollierte pH-Wert sorgen für ein hervorragendes Wachstumsmedium. Verwenden Sie immer gereinigtes Wasser. Leitungswasser kann einen Überschuss an Metallionen aus den Rohren enthalten, was die Abfangfähigkeit des EDTA überfordern kann. Wenn Sie vermuten, dass in Ihrer Probe interferierende RNA vorhanden ist, fügen Sie RNase A in einer Menge von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu Ihrem GTE-Puffer hinzu, um das Problem zu beheben.
